Laboratoire d'accueil : Laboratoire de Radioécologie et d'Ecotoxicologie (LRE) 

Date de début de thèse : 03/11/2010

Nom du doctorant : Guillaume Bucher

Contexte et intérêt

Il est admis depuis une trentaine d'année que ni la concentration totale d'un métal en solution ni sa concentration dissoute ne sont de bons indicateurs de sa biodisponibilité ni de sa toxicité (Campbell, 1995; Bergman et al., 1997; Janssen et al., 2000).
Ainsi de nombreuses approches et concepts ont été développés pour évaluer la biodisponibilité des métaux à partir de leur spéciation en milieu aqueux (Paquin 2002), introduisant notamment la notion d'ion libre et de complexes labiles; des revues comme celle de Svadleykova et Wilkinson (Svadleykova et al., 2005) répertorient les avantages mais aussi les limites et voies de développement actuelles de ce type d'approches.
Une alternative à ces approches "amont" proposée dans ce sujet de doctorat, est la détermination de la spéciation des métaux dans les tissus biologiques eux-mêmes, après absorption, afin de mieux appréhender leurs flux biologiques, e.g. transport, absorption, élimination, stockage, et ainsi leur toxicité. En effet, la caractérisation des biomolécules impliquées dans les processus métaboliques ou interagissant avec un élément est un point clé pour élucider la toxicité de cet élément (Szpunar, 2004). Cependant la détermination de la spéciation biologique nécessite avant tout une connaissance précise de la distribution de l'élément dans le milieu d'intérêt et demeure un challenge analytique: les principaux problèmes rencontrés sont en effet:

• le risque de dénaturation de la métallobiomolécule, dénaturation qui peut se produire durant n'importe quelle étape de la purification de l'analyte en raison de la faible liaison des complexes métal·biomolécule,
• l'extraction/récupération du complexe métal-biomotécule intact pour son identification,
• le manque de sensibilité lorsque la métallobiomolécule est peu abondante, 
• l'ionisation insuffisante de l'analyte en raison d'une grande complexité de la matrice de l'échantillon.

Des études menées précédemment au Laboratoire de Radioécologie et d'Ecotoxicologie de l'IRSN ont montré qu'après exposition chronique à de l'uranium, le Danio rerio accumule ce métal dans de nombreux organes et notamment au niveau des branchies (Buet, 2005 ; Barillet, 2007). Cependant, les données dénotent une certaine variabilité inter-individus, pouvant être expliquée par une plus ou moins grande capacité des individus à stocker l'U au niveau branchial dans des granules. Par ailleurs, une accumulation de l'U non proportionnelle à la concentration d'exposition laisse présager d'interactions U-ligand propres, comme il existe pour le cadmium (WHO 1992) et non comme proposées par le BLM (Modèle du Ligand Biotique). En effet, l'uranium, élément électropositif ayant une chimie de coordination très importante, est susceptible de former de nombreux complexes (covalents ou non) avec les biomolécules riches en atome électronégatifs tels que les protéines, les peptides ou les acides nucléiques (Frelon, 2009 ; Dedieu, 2009). De plus, il est susceptible de perturber le métabolisme d'éléments essentiels (Fe, Ca) (Donnadieu-Claraz, 2007) ou d'induire des modulations de certaines expressions géniques (Taulan, 2004 ; Berradi, 2008 ; Lerebours, 2009) ou protéiques (Barillet, 2007 ; Bourrachot, 2008), impliquant ainsi potentiellement d'importants dysfonctionnements.
Restent cependant à déterminer le nombre et la nature des protéines impliquées dans la complexation de l'uranium, la spécificité de ces interactions ainsi que leur conséquence (inactivation des protéines en les dénaturant ou substitution aux métaux stables, sans perturber la biochimie).
L'ensemble de ces éléments et le fait que l'uranium soit un toxique chimique mais aussi radiologique, soulignent l'intérêt qu'il y a pour la détermination d'une distribution fine et de la spéciation biologique de l'uranium dans les branchies de poisson zèbre après exposition. En effet, elles sont une des voies d'entrée du contaminant, subissant elles-mêmes des atteintes histologiques et pouvant jouer le rôle de première barrière pour le reste de l'organisme.
Relier la spéciation de cet élément à la toxicité, objectif majeur de ce projet de thèse pourrait permettre in fine d'implémenter les modèles d'évaluation du risque existant sur l'uranium.

Stratégie et Moyens

Située à l'interface chimie/biologie, cette étude développera tout d'abord une recherche ex vivo de cibles protéiques avec lesquelles l'uranium serait particulièrement lié au niveau branchial chez le poisson après exposition (différents temps, différentes concentrations). Cette approche de bioaccumulation préférentielle nécessitera la mise en oeuvre de méthodologies croisées et l'utilisation de nombreux outils analytiques complémentaires de séparation protéique, de détection de l'uranium et de caractérisation des protéines; en effet nous proposons, après préparation des échantillons de :

• Continuer l'optimisation des protocoles non dénaturants pour l'électrophorèse sur gel bidimensionnelle pour la séparation des complexes uranium-protéine en préservant leur stabilité (Becker, Mounicou et al., 2008).
• De développer une stratégie d'imagerie de haute sensibilité pour l'uranium dans les gels d'électrophorèse 2D par ablation laser couplée à l'ICP MS (Ballihaut et al., 2007)
• Caractériser tes complexes intacts uranium-protéine ou uranium-métabolite. La stratégie (Basset et al., 2(08) combinera une méthodologie chromatographique multidimensionnelle pour la séparation des complexes intacts avant leur introduction dans un spectromètre de masse moléculaire de haute résolution (FT-MS (Orbitrap))

Parallèlement, des analyses par microscopie (optique ou MET) de l'organe seront réalisées pour se recaler par rapport aux études précédentes au niveau atteintes histologiques et pour microlocaliser de potentiels granules d'uranium ; de même des analyses ICPMS de l'uranium total contenu dans les différents organes du poisson et dans les différentes fractions de la branchie seront réalisées pour connaître leur niveau d'accumulation respectif.
En fonction du temps, les interactions U - Protéines cibles seront étudiées in vitro en étudiant à la fois les constantes d'association de l'uranium avec une fraction protéique témoin et les réactions de compétitions de l'uranium avec des métaux stables tels que Fe/Zn/Cu/Ca. De même, l'activité des protéines cibles de l'uranium pourra être évaluée pour connaître l'impact de la complexation par U.
Ce projet s'appuiera sur l'expertise conséquente du LRE sur le modèle biologique utilisé, le contaminant ainsi que ses effets toxiques sur le modèle, sur la maîtrise du LCABIE d'outils analytiques de pointe indispensables à la détermination de la spéciation en milieu biologique, sur les mises au point et résultats obtenus lors de précédentes collaborations entre S. Mounicou et S. Frelon (cf article Rad Act), lors du DEA de S. Vanquerp (spéciation corbi) mais aussi sur les développements actuellement réalisés au LRE (travaux de S. Frelon & L. GuiUoreau)