Laboratoire d'accueil : Laboratoire de radiopathologie et de thérapie expérimentale (LRTE)

Date de début de la thèse : 01/10/2008

Nom du doctorant : Raphaëlle Bessout

Résumé

Nous avons montré qu'une injection de cellules souches mésenchymateuses (CSM) stimule la ré-épithélisation de la muqueuse colique et semble participer à sa régénération fonctionnelle (modèle de rat SD-irradiation colorectale).

Dans ce contexte, l'objectif de ce projet de thèse consiste à étudier :

• Dans quelle mesure l'injection des CSM modifie le processus innammatoire après irradiation.
• Quels sont les processus moléculaires inflammatoires induits par les CSM qui participent à la réparation des lésions radio·induites.
  

Contexte scientifique et travaux du laboratoire sur la thématique

Une irradiation abdomino-pelvienne à forte dose entraîne une déplélion épithéliale, voire une dénudation de la surface luminale intestinale. L'atrophie de la muqueuse est souvent compliquée par une ulcération, une sclérose vasculaire et des dilations lymphatiques. L'ulcération résulte de la nécrose tissulaire issue de l'action des radicaux libres générés par l'irradiation, de la persistance des processus inflammatoires et de l'ischémie locale associée aux dommages de la vascularisation et micro-vascularisation.

Pour les tissus intestinaux l'efficacité du processus cicatriciel résulte de la capacité des cellules épithéliales à migrer et proliférer, de la synthèse d'une matrice saine par les fibroblastes et de mise en place d'une angiogénèse efficace par les cellules endothéliales. Une ulcération mal cicatrisée peut évoluer en un processus inflammatoire chronique, voire une fistulation. La gestion clinique de ces complications est complexe et exige des traitements anti-inflammatoires, immunomodulateurs et éventuellement de l'oxygène hyperbare. Dans les cas les plus sévères une stomie de décharge peut être nécessaire pour aider à la cicatrisation.
Malgré le grand nombre de molécules disponibles, la complexité physiopathologique de ces lésions et le contexte septique intestinal limitent l'efficacité des thérapies disponibles.

En médecine régénérative. la thérapie cellulaire est une approche dont l'apport porrait s'avérer décisif pour le traitement des lésions radio-induites. La thérapie cellulaire est aujourd'hui largement utilisée en hématologie et pour le traitement des brûlures. Pour certaines maladies hépatiques, le diabète et les affections neuro-dégénératives, cette approche est encore au stade expérimental. Bien que les cellules souches endogènes de l'intestin puissent être aujourd'hui purifiées, la difficulté de leur expansion au cours du temps est un obstacle à l'étude de leur potentiel de régénération intestinale et à leur utilisation en clinique dans certaines pathologies. L'utilisation de cellules souches dérivées de la moelle osseuse (contenant principalement des cellules souches hématopoïétiques et des cellules souches mésenchymateuses) comme autre source pour la régénération tissulaire de l'intestin a été proposée et expérimentalement étudiée dans la littérature.
Au sein du laboratoire, les cellules souches adultes utilisées dans nos essais pour la cicatrisation de lésions radio-induites sont les cellules souches mésenchymateuses (CSM).
Ces cellules sont facilement accessibles chez tous les individus, multipotentes (capacité de différenciation en différents types cellulaires in vitro) et possèdent des propriétés immunomodulatrices.
Nos travaux ont montré, dans un modèle de souris NOD/SCIO, qu'après irradiation, les CSM humaines greffées colonisent l'ensemble des organes altérés (Chapel Gene Medecille 2003. François, Stem Cell 2006). L'étude de la régénération tissulaire au niveau de la peau et l'intestin montre que l'implantation des CSM accélère ce processus. Au niveau de l'intestin, les CSM rétablissent l'homéostasie cellulaire de l'épithélium (balance physiologique prolifération/apoptose des cellules souches), favorisent une restauration structurale (Sémont Adv. Exp. Med. Biol 2006) et fonctionnelle. Au niveau tissullaire, les effets bénéfiques des CSM dans les phases aiguës des lésions radio-induites pourraient être attribués à différents processus tels que le contrôle du processus inflammatoire, la protection de différents types cellulaires contre l'apoptose radio-induite et/ou la stimulation des cellules souches tissulaires.

Objectifs et déroulement de la thèse

But

Caractériser les modifications du processus inflammatoire après irradiation colorectale suite à l'injection de CSM.
Définir les processus moléculaires inflammatoires induits par les CSM qui favorisent/participent à la réparation des lésions radio-induites.

Modèle

Ce projet sera réalisé sur un modèle rat Sprague Dawley (SD) mis au point au sein du laboratoire. Les rats subissent une irradiation colorectale de 27Gy. Ce modèle d'irradiation permet d'induire des lésions histologiquement proches de celles observées chez l'homme. Les lésions radio-induites entraînent des dommages irréversibles au niveau du colon, conduisant au décès par occlusion des animaux après 10 à 12 semaines.
Des CSM issues de rat GFP SD sont injectées 24h après irradiation. Nous avons démontré les bénéfices induits par la greffe de CSM sur le processus de ré-épithélisation de la muqueuse colique (oedèmes, ulcères, tailles des cryptes).

Projet

Dans un premier temps, il s'agira de décrire le processus inflammatoire après une injection de CSM suite à des lésions colorectales radio-induites. Pour cela des immunomarquages permettront de définir les cellules immunitaires impliquées. Les cellules du système immunitaire inné (macrophages et neutrophiles) mais aussi spécifique (Lymphocytes T et B) seront étudiées. Par des techniques de biologie moléculaire, l'expression des cytokines et facteurs de croissance sera analysée in vivo. Ces études seront effectuées au niveau des différents compartiments de la paroi colique (muscle et muqueuse) mais aussi au niveau des organes lymphoïdes secondaires (plaques de Peyer et ganglions lymphatique). Ces différentes analyses permettront de déterminer les modifications de la réponse immunitaire à des temps précoces mais il sera également intéressant d'effectuer les mêmes analyses pour des temps tardifs (8 semaines).

La deuxième partie du projet consiste à étudier l'effet du processus inflammatoire sur la réparation tissulaire. La cicatrisation dépend de différents processus dans lesquels la prolifération tient une part importante. Les cellules immunitaires synthétisent de nombreux facteurs de croissance qui pourraient être impliqués dans le processus de réparation. Afin d'étudier l'implication spécifique des cellules immunitaires, ces dernières seront prélevées ex vivo à partir de rats greffés avec des CSM et mises en présence avec des cellules constituant l'intestin. Il a été montré que les lymphocytes intra-épithéliaux, présents en grand nombre au sein de la lamina propria, pourraient agir sur la prolifération des cellules souches épithéliales (Yang H. Journal of Immunology, 2004). Il s'agira donc de tester l'effet des lymphocytes intra-épithéliaux sur la prolifération des cellules souches épithéliales et des myofibroblastes de l'intestin. Les facteurs protéiques impliqués dans ces processus pourront être identifiés par l'analyse des sumageants de culture.

Ces travaux s'inscrivent dans un projet visant à la compréhension des mécanismes d'action des CSM sur le bénéfice des réparations tissulaires radio-induites. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans le processus de régénération et permettre, à terme, l'amélioration des protocoles d'injection de CSM.