Laboratoire d'accueil : Laboratoire de radiopathologie et de thérapie expérimentale (LRTE)

Date de début de thèse : 03/11/2009

Nom du doctorant : Jean-Victor Lacave-Lapalun

Problématique

A la suite d'irradiations sévères accidentelles touchant le tractus gastro-intestinal, la régénération rapide de l'épithélium est fortement altérée. Cette absence de renouvellement de l'épithélium associée à l'apparition d'ulcères réfractaires est souvent une des causes de décès des patients (Hirama, 2005). Les travaux de recherche réalisés au sein du laboratoire ont évalué le bénéfice apporté par une greffe de CSM sur les cinétiques de régénération structurale et fonctionnelle de l'intestin dans un contexte d'atteintes gastro-intestinales radio-induites.
La persistance des CSMs au site de lésion repose sur deux critères : le maintien de ces cellules et l'absence de réponse immunitaire contre ces cellules. Les CSMs possèdent de multiples fonctions, et en particulier la fonction d'immunomodulation cruciale pour leur implantation. Au vu de la faible présence de ces cellules sur le site lésionnel, il n'est donc pas aussi évident que ces cellules trouvent un microenvironnement immunitaire optimal pour une implantation efficace. L'irradiation induit une inflammation conduisant à un contexte environnemental pouvant être hostile à l'implantation des CSMs. En effet, l'irradiation abdominale induit une réaction inflammatoire aigüe caractérisée par une infiltration de macrophages et de neutrophiles. Cette réaction inflammatoire implique un profil de cytokines particulier avec une répression de l'IFN-g (Linard 2004 ; Grémy 2006) entraînant une orientation immunitaire avec une polarisation des cellules T Helper (CD4+) vers une prédominance de type Th2 (Gremy 2006). Ce déséquilibre immunitaire est exacerbé par un défaut de la tolérance (Grémy 2006).

 
Une des stratégies récemment évoquée pour potentialiser l'effet d'une transplantation est d'augmenter la tolérance par l'activation du système immunitaire inné. Ce système emploie une unique stratégie de tolérance envers tous les agents pathogènes ou non conférée par les TLR (Toll-Like-Receptor). Très récemment, l'activation des TLRs est devenue une cible thérapeutique dans les maladies inflammatoires intestinales (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique) (Harris, 2006). L'activation de ces TLRs induit une préservation de l'épithélium, une inhibition de l'apoptose et de l'inflammation, une accélération de la réparation et régénération tissulaire, une exclusion de l'agent pathogène, un maintien de la tolérance immunitaire et un lien à l'immunité adaptative (Cario, 2008). Un effet radioprotecteur de l'activation du TLR5 a été démontré au niveau intestinal par une inhibition de l'apoptose induite par l'irradiation (Burdelya, 2008). Mais à l'inverse, une stimulation excessive des TLRs entraine une perpétuation de l'inflammation chronique et un risque de tumorigénèse (Cario, 2OOS). Un fin équilibre doit être établi. Un certain nombre de travaux montrent des effets contradictoires du bénéfice d'activation des TLRs en soutien du traitement par thérapie cellulaire. En effet, il a été montré que l'activation de l'immunité innée via les TLRs peut être une barrière contre l'implantation de greffon (Liotta, 2008). A l'inverse, les TLRs présents sur les MSCs induisent leur différenciation, leur migration, leur prolifération et leur immunomodulation (Pevner-Fischer, 2008, Tomchuck, 200S, Yu, 2008). D'autre part, l'activation des TLRs oriente la réponse immunitaire, en particulier stimule la sécrétion d'IFN-g par les cellules immunitaires (CD4+, CDS+ et NK) induisant ainsi une réponse immunitaire de type Th1 (Katakura, 2005; Muller, 2006). Cette propriété peut s'avérer fondamentale en rétablissant le déficit Th1 induit par l'irradiation. En effet, le potentiel de régénération tissulaire ainsi que les propriétés immunorégulatrices des CSMs sont profondément influencées par des facteurs microenvironnementaux où l'IFN-g a un rôle clé.
Sous faible concentration d'IFN-g ou en présence d'un anticorps anti-IFN-g (Krampera 2006) les CSM prennent des caractéristiques de cellules présentatrices d'antigènes (APC) et engendrent une réaction immunitaire (Stagg, 2006) entrainant un risque de rejet de greffe de ces cellules. L'engagement de l'activation des TLRs contribue à la résistance versus susceptibilité du tissu à tolérer la transplantation. L'activation des TLRs est nécessaire à l'acquisition du caractère multipotent des CSMs (Pevsner -Fischer, 200S). Le rétablissement d'un équilibre immunitaire en activant les TLRs peut être une voie de potentialisation de la reconstruction tissulaire par les CSMs.

Objectif

Les objectifs de ce projet de thèse, sur un modèle d'irradiation abdominale chez le rat sont:

• d'évaluer si l'activation ou la répression de certains TLRs par leurs ligands spécifiques améliore le statut immunitaire de l'intestin irradié.
  En précisant la réponse immunitaire (Th1/Th2, Treg) et inflammatoire engendrée par l'injection des différents ligands Pam3Cys, LPS, Flagelline, ou le motif bactérien CpG pour les TLR2, TLR4, TLR5 et TLR9 respectivement.
• d'évaluer si la modulation de l'immunité de l'hôte par les TLRs est un apport bénéfique pour le traitement par thérapie cellulaire utilisant les CSMs des lésions radio-induites.
  En précisant si la modulation de l'activation des TLRs améliore l'efficacité thérapeutique des MSCs et de leur produit de sécrétion.

Stratégies

Objectif 1 : Rétablissement du statut immunitaire par modulation de l'activité des TLRs.

• Cinétique du niveau d'expression des TLRs (2,4,5,9) induit par une irradiation abdominale (intestin grêle et colon-rectum) à une dose moyenne et une dose ulcérante. L'expression (gène et protéine) ainsi que la localisation des TLRs par immunohistologie seront estimés à plusieurs temps (précoce et tardif) post- irradiation.
• Caractérisation in vivo de l'effet d'activateur spécifique (Pam3Cys, LPS, flagelline, motif GpC, respectivement) des TLR 2, 4, 5, 9 sur le statut inflammatoire et immunitaire. Le but est de restaurer un équilibre immunitaire en cytokine, particulièrement l'IFN-g. Le statut inflammatoire sera évalué par la présence tissulaire de cellules inflammatoires (macrophages, neutrophiles) déterminée par marquage immunohistologie et l'expression de cytokines inflammatoires. Le statut immunitaire sera caractérisé par l'expression de cytokines, de facteurs de transcription de type Th1 et Th2 et l'évaluation du statut de tolérance par le niveau de présence des Treg (histologie et expression). Cette étude sera complétée par une étude in vitro de l'effet de l'activation des TLRs sur des cellules CD4+ et CD8+ isolés de l'intestin irradié à plusieurs temps post-irradiation. Cette étude permettra de préciser sur quel type cellulaire l'activation des TLRs agit pour restaurer l'équilibre immunitaire, notamment sur les taux d'expression d'IFN-g.
  

Objectif 2: Potentialisation de la modulation des TLRs sur l'effet thérapeutique des CSMs.

 
Sur une lésion intestinale radio-induite établie, l'effet de la modulation des TLR 2, 4, 5, 9 sera analysé sur l'efficacité de l'implantation des CSMs.

• L'efficacité de l'implantation des CSMs sera estimée par une pré-incubation des CSMs en présence des différents ligands des TLR avant injection à l'animal afin de conditionner les CSMs,
• Les animaux seront immunitairement orientés par les ligands des TLRs avant injection des CSMs. L'efficacité de l'implantation sera estimée par des analyses histologiques, des critères inflammatoires (présence neutrophiles, macrophages, cytokines exprimées) et immunitaires (profil Th1/Th2, Treg).